除了能够产生不同类型的抗体，羊驼与鼠、兔的区别还包括运输、饲养、免疫操作的成本更高，这与纳米抗体的市场需求形成了一定程度上的矛盾。因此，市场上对羊驼进行二次免疫的操作逐渐浮现。然而，这种看似节约的抗体开发方式，实际上会带来巨大的风险，为下游纳米抗体的应用开发引入无限的不确定性。本文将详细阐述“零免疫背景”的重要性，亦即羊驼二次或多次免疫的缺点。
ONE：免疫干扰
已免疫羊驼的免疫系统因接触过其他抗原，其B细胞库中存在大量针对既往抗原的VHH基因。当利用新抗原进行免疫时，这些预存的记忆B细胞会优先扩增，即有可能导致抗原表位覆盖不足、交叉反应干扰的风险。
表位偏好性偏移
既往免疫可能诱导羊驼对某些表位产生免疫耐受或过度竞争。例如，在新冠病毒刺突蛋白研究中，已免疫羊驼产生的抗体集中于非关键表位（如S2亚基），而零免疫羊驼则更易靶向中和表位（如RBD区）;
交叉反应性干扰
预存抗体可能与新抗原发生非特异性结合。例如，针对GPCR靶点的抗体可能因结构相似性与既往抗原结合，导致假阳性筛选结果，需通过表位定位或竞争实验额外验证。
事实上，免疫干扰最大的问题来源于对既往抗原的未知。由于部分客户在寻求羊驼免疫服务提供方的免疫服务时，会隐去抗原名称、类型和抗原标签，在进行二次免疫时，很难确定新的抗原与旧的抗原是否存在一致性或者冲突，导致免疫失败、亲和力不足甚至非特异性过高等结果。
TWO：免疫文库污染
由于羊驼已进行过免疫而导致的抗体结合能力不足导致的免疫干扰问题会进一步导致免疫文库遭受既往抗原的污染。使得目标抗体比例下降、筛选效率大幅降低的风险。
目标抗体比例下降
在噬菌体展示文库中，非目标抗体（如针对既往抗原的VHH）可能占据50%以上的库容量；
筛选效率降低
大量非特异性抗体需通过多轮“预清除”（Pre-clearing）或额外筛选步骤排除，导致工作量增加2-3倍，且可能遗漏低丰度高亲和力抗体。
THREE：抗体多样性受限
已免疫羊驼的B细胞经历多次克隆选择后，其VHH基因库的多样性显著降低。
框架区（FR）同源化
既往免疫可能导致FR区基因趋同，限制抗体结构多样性；
互补决定区（CDR）保守化
CDR3长度可能缩短（平均减少2-3个氨基酸），削弱对复杂表位的识别能力。而CDR3长度的缩短会显著降低纳米抗体的优势。
FOUR：人源化改造成本及亲和力成熟难度提升
已免疫羊驼体内纳米抗体的VHH序列可能携带更多非人源化特征。
免疫原性热点残留
既往抗原刺激可能导致抗体表面暴露出更多羊驼特异性表位，需通过定点突变或CDR移植消除，改造步骤增加30%-50%；
糖基化位点干扰
部分已免疫抗体因既往抗原需求保留糖基化修饰（如Asn-X-Ser/Thr基序），需更换表达系统（从原核转向真核），生产成本提升2倍以上；
预存突变干扰
已免疫抗体的VHH基因可能积累随机突变，例如在FR2区出现非功能性突变（如Pro→Leu），需通过反向突变恢复稳定性；
亲和力优化空间压缩
既往免疫可能使抗体亲和力（KD值）已接近平台期（如10^-8 M），进一步优化需引入高风险突变，如破坏结构稳定性的CDR插入。
FIVE：功能性设计受限及免疫原性不可控
由于已免疫羊驼体内的纳米抗体可能携带既往免疫抗原相关的糖基化修饰，进而导致其抗体结构刚性的增加、表位冲突风险以及免疫原性不可控的提升。
结构刚性增加
已免疫抗体的构象可能因既往结合需求趋于固定，限制其与融合蛋白（如IL-2偶联）的协同作用；
表位冲突风险
工程化改造涉及双特异性抗体设计，既往抗体的表位结合模式可能与新靶点产生空间位阻；
免疫原性不可控
由于既往免疫原的糖基化修饰，其VHH片段的N-糖基化位点出现频率是零免疫组的3倍，这种修饰会影响抗体的药代动力学特性，甚至引发免疫原性反应；
SIX：知识产权风险及整体成本提高
使用已免疫羊驼可能引发专利纠纷。据统计，全球已公开的羊驼相关抗体专利中，约有41%的专利涉及特定抗原的免疫方案。如果使用已免疫的羊驼开发相关抗体，可能因落入现有专利保护范围而面临法律风险。
由于潜在的免疫失败或效价过低的情况，使用已免疫羊驼可能导致整体研发成本增加三至六成，主要体现在以下方面。
时间成本
文库筛选周期延长（从4周增至8周）；
验证成本
交叉反应检测、表位定位等附加实验；
生产风险
由工程化抗体因结构不稳定导致的批次失败率上升。
总结
因此，采用二次免疫羊驼进行抗体开发，看似节约了成本，但其潜在的风险和后续成本的增加，可能是无法估量的。无论是文库污染，还是表位偏移，抑或是抗体工程化障碍等问题，都会使整个研发进程陷入低效高耗的困境。在精准医疗时代，选择“零免疫背景”羊驼，从源头上规避抗体药物开发的潜在问题，不仅是技术和投入双重最优解，更是对抗体药物临床转化成功率的核心保障。
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