纳米抗体制备与特性优化
代谢型谷氨酸受体2(mGlu2)同源二聚体作为调节脑内谷氨酸能活性的关键靶点，已在精神分裂症等疾病的临床研究中被验证，但此前针对该靶点的药物因效果不佳或副作用问题失败。因此，研究团队专注于开发一种能穿透血脑屏障、精准靶向mGlu2，且具备半衰期长、治疗效能高的新型治疗性抗体。
此前，团队已研发出纳米抗体DN13，它可特异性结合mGlu2受体并对其进行正向调节，具备靶向mGlu2的基础优势。为进一步提升其效能和脑部作用潜力，研究团队创新性地将DN13与另一个结合mGlu2但不激活它的纳米抗体DN1，通过特殊的连接子(Linker)连接起来，构建了双价双特异性纳米抗体DN13-DN1。
如下图所示，这种双价设计带来了巨大优势并在后续实验中得到验证。通过饱和结合实验与功能活性检测，结果显示：在激动剂LY379268存在下，DN13-DN1对mGlu2的表观亲和力(Kd=0.50nM)较单体DN13(Kd=4.10nM)提升10倍；其PAM效价(EC50=1.76nM)较DN13(EC50=101nM)提升近2个数量级，且仅特异性结合mGlu2同源二聚体，不与其他mGlu受体交叉反应，为后续实验奠定了高特异性与高效能的分子基础。
图1:DN13–DN1纳米抗体可增强受体激活
纳米抗体脑穿透性验证
为确认DN13-DN1能否通过外周给药进入脑内，团队采用腹腔注射方式，结合氚标记与免疫组化技术开展研究。将DN13-DN1标记为 [³H]DN13-DN1后腹腔注射，定量检测显示：给药后4小时，脑内放射性占给药剂量的0.08%，估算脑浓度达9.2nM(约 20*Kd)；7天后脑内浓度仍维持1.5nM(约3*Kd)，均高于有效作用浓度。
免疫组化结果进一步证实，给药24小时后，DN13-DN1在腹侧被盖区(VTA)、大脑皮层等mGlu2高表达区域特异性分布，而对照组(生理盐水注射)无阳性信号。放射自显影实验也观察到类似的脑区分布特征，明确证明DN13-DN1可穿透血脑屏障并在脑内特定区域富集留存。
图2:DN13–DN1可穿透血脑屏障且具有长效性
动物模型的行为学改善治疗效果验证
为进一步确认DN13-DN1的治疗效果，研究团队选择了新生期PCP诱导模型(模拟精神分裂症)GluN1-KD遗传模型(模拟GRIN1障碍)这两种经典的NMDA受体功能低下相关小鼠模型进行验证。
新生期PCP诱导模型：
NMDA受体功能低下是精神分裂症的核心病理机制之一，因此研究团队通过在小鼠新生期(P7、P9、P11)皮下注射NMDA受体拮抗剂PCP，构建出具有精神分裂症样认知缺陷的小鼠模型。成年后，采用新物体识别(NOR)测试评估识别记忆，测试流程分为训练阶段与测试阶段，并分别设置24小时和7天的记忆保留期，以验证药物的短期与长期效果。结果显示：单次腹腔注射10mg/kg的DN13-DN1，在24小时后PCP模型鼠的识别记忆显著恢复，效果与mGlu2/3激动剂 LY379268(1mg/kg 腹腔注射)相当；作为对照，中性抗体DN1无改善作用，而mGlu2拮抗剂LY341495可完全阻断DN13-DN1的效果，证实其作用依赖mGlu2激活。关键的是，在7天保留期测试中，LY379268已无治疗效果，而DN13-DN1仍能有效改善识别记忆，凸显出长效治疗优势。
图3：DN13–DN1对新生期PCP诱导的精神分裂症小鼠具有显著治疗作用
GluN1-KD遗传模型：
该模型通过降低GluN1亚基表达，导致NMDA受体功能部分缺失，模拟人类罕见病GRIN1障碍。团队采用Y迷宫测试评估工作记忆，前脉冲抑制(PPI)测试评估感觉运动门控。Y迷宫测试结果显示：单次腹腔注射20mg/kg DN13-DN1，3小时后GluN1-KD小鼠的工作记忆显著提升，与LY379268效果相当；7天后再次测试，DN13-DN1组仍维持改善效果，LY379268组则无明显作用。
PPI测试结果表明：给药3小时后，DN13-DN1可改善81dB前脉冲强度的PPI缺陷；7天后效果进一步增强，对69dB、81dB两种前脉冲强度均有改善作用，且不影响听觉惊跳反应(ASR)，证明其可有效修复感觉运动门控功能。
图4：DN13–DN1可改善GluN1-KD小鼠的工作记忆和感觉门控
亚慢性治疗安全性评估及优势对比
为模拟临床长期用药场景，团队设计亚慢性给药方案：初始腹腔注射10mg/kg DN13-DN1，后续每间隔1周注射 1mg/kg，共4次给药。结果显示：在两种模型中，亚慢性治疗均能稳定维持识别记忆、工作记忆与感觉运动门控的改善效果，且无性别差异，不影响小鼠体重。
安全性检测发现,DN13-DN1不改变脑内mGlu2受体表达，不影响小鼠运动协调、平衡与僵住行为；其含有的内毒素(LPS)浓度低于神经毒性阈值，进一步纯化后治疗效果无差异，排除了内毒素干扰，证实其安全性。
图5：DN13–DN1亚慢性给药方案可改善两种精神分裂症小鼠模型的行为缺陷
为凸显纳米抗体优势，团队将DN13-DN1与小分子药物LY379268、IgG类抗体DN13-Fc进行对比。结果显示：在长效性上，DN13-DN1单次给药效果维持7天，LY379268仅急性有效；在脑内作用上，DN13-Fc(80kDa)腹腔注射后无任何行为改善效果，而DN13-DN1因小尺寸具备更优的血脑屏障穿透性，证实纳米抗体在脑疾病治疗中的独特优势。
图6：DN13–Fc在两种精神分裂症小鼠模型中无急性行为效应
DN13-DN1的核心优势源于其独特的分子设计与作用机制。从结构上看，它仅15kDa的极小体积，使其能穿透血脑屏障并在脑内特定区域富集，这是传统IgG类抗体无法实现的；从特异性上看，它仅结合mGlu2同源二聚体，不与其他mGlu受体交叉反应，避免了脱靶副作用；从作用机制上看，作为阳性变构调节剂(PAM)，它仅在内源性谷氨酸存在时增强mGlu2信号，既保留了生理信号的时空特性，又避免了受体过度激活导致的脱敏问题。此外，双价设计大幅提升了其对mGlu2的亲和力与效能，使其在脑内滞留时间长达7天，单次给药即可实现长效治疗，显著提高患者用药依从性。
这项研究成果不仅是纳米抗体技术在脑疾病治疗领域的重大突破，更是对于由NMDA受体功能低下引起的多种中枢神经系统疾病的治疗，特别是一些认知障碍阴性症状的精神分裂症，以及遗传性GRIN1障碍的治疗带来了革命性的治疗策略，为全球数百万患者带来新的希望。
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