研究背景与挑战
超极化激活和环核苷酸门控（HCN）通道由四个人类基因（hcn1-4）编码，这些基因以细胞类型特异性的方式广泛表达，分布于心脏和神经系统中。它们通过膜超极化和环状核苷酸激活，构成了所谓的起搏电流I。HCN通道产生的起搏电流是心脏和神经元自发节律性活动的电生理基础。因此HCN4功能丧失与症状性窦性心动过缓、窦房结功能障碍等疾病直接相关。目前唯一临床药物伊伐布雷定是通道阻滞剂，且缺乏亚型特异性，无法用于需要增强HCN4功能的治疗，可见临床需求迫切。
开发能特异性增强（而非抑制）HCN4功能，且作用于细胞外、避免干扰复杂细胞内信号通路的工具或药物是本项研究的技术瓶颈。
研究方法与技术亮点
筛选策略：
本研究中采用酵母展示技术，从一个合成纳米抗体文库（非动物免疫来源）中进行筛选，采用磁激活细胞分选（MACS）和流式荧光激活细胞分选（FACS）进行分选。
使用构象特异性筛选：
以开放构象的HCN4蛋白作为“正筛选”抗原，以封闭构象的HCN4蛋白作为“负筛选”抗原，旨在寻找可能调控通道功能的结合剂。
功能鉴定：
通过膜片钳电生理学，在表达不同HCN亚型（HCN1， HCN2， HCN4）及相关通道（hERG）的HEK293细胞上，系统测试了候选纳米抗体的活性和特异性。NB5脱颖而出，在10个候选抗体中，仅NB5对兔和人的HCN4具有高度特异性的激活作用，而对HCN1、HCN2、hERG均无影响（见图1）。
图1. NB5对rbHCN4的功能影响
NB5的核心特性与机制
功能效应：
NB5使HCN4通道的电压依赖性激活曲线向去极化方向（右移）约9-10 mV。这种右移导致在生理相关的膜电位范围内，通道开放概率增加，起搏电流增强。其效应与内源性激动剂cAMP可叠加，说明两者通过相互独立的路径发挥作用（见图2）。
图2. NB5在cAMP存在下的作用
作用靶点鉴定（关键发现）：
利用NB5能激活人/兔HCN4但不能激活小鼠HCN4的特性，通过序列比对，将结合位点锁定在孔区S5-P-螺旋环。
关键残基：D448和N456（兔HCN4编号）。这两个残基在人和兔中保守，但在小鼠中不同。
突变验证：将兔HCN4的D448和/或N456突变为小鼠对应的氨基酸，会显著削弱或完全消除NB5的激活效应；反之，将小鼠HCN4的对应位点突变为人/兔的氨基酸，则能赋予其对NB5的部分敏感性。
结合位点位置：结构模型显示，这两个残基位于孔道外侧的“炮塔”区域，完全暴露于细胞外液，这解释了NB5为何能从细胞外发挥作用。（见图3、图4）
图3. rbHCN4上NB5结合位点的鉴定
图4. NB5对HCN4致病变异K531N的影响
本研究不仅成功开发了首个靶向HCN4的细胞外激活型纳米抗体NB5，更通过它发现了一条调控HCN通道功能的新路径。NB5在多个实验层面（重组系统、天然细胞、人类疾病模型）均展现出逆转起搏功能低下的潜力，为开发治疗症状性窦性心动过缓的新一代生物制剂奠定了坚实的基础。同时，这项工作也为利用纳米抗体作为工具探索离子通道的复杂门控机制提供了范本。
本文中NB5纳米抗体是通过合成文库筛选得到的，但合成文库筛选抗体稳定性不高；若通过免疫文库筛选，离子通道蛋白的抗体发现最大的难点之一是蛋白类抗原制备非常困难，细胞类抗原背景过高，因此，可采用RNA作为免疫原。武汉纳博生命提供现货RNA抗原，特别针对Alpaca的应用进行了密码子优化及RNA二级结构优化，使其在羊驼中的免疫效果更佳，帮助客户快速开启免疫流程，针对膜蛋白及各类通道蛋白，提供更多的免疫原制备方案。
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纳博生命专注于纳米抗体开发、改造与应用，致力于构建产、学、研一体化的实验公共服务平台。现拥有从抗原制备(多肽、蛋白及RNA)，到抗体发现和抗体工程，再到生物学功能验证/筛选的全链路技术平台。其中RNA抗原包括针对羊驼进行RNA结构和序列优化的RNA；抗体发现与抗体工程服务采用噬菌体展示、RNA以及哺乳动物细胞展示在内的多种技术路线。通过多平台的交叉互补为药企及科研院所提供灵活的抗体发现及改造服务，助力药物试剂的研发。
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