现在，你无需经过羊驼免疫，通过天然文库筛选即可获得想要的纳米抗体序列。纳博生命构建的羊驼VHH天然文库，里面包含了来自不同羊驼个体的VHH基因的多样性序列，只需客户提供抗原，就可以直接进行筛选。天然文库的优势在于：周期短、库容大、品质高。库容达1.3*1011cfu/mL，库品质高，2-3周即可获得特异性好的纳米抗体序列。适用于对羊驼有毒性的抗原以及低免疫原性的抗原。
羊驼VHH天然文库构建和流程测试
羊驼VHH天然文库构建，第一步是PBMC的分离，以下是步骤和流程。
（1）往已加入抗凝血剂的静脉外周血中加入等体积的D-PBS稀释，混合均匀。
（2）将淋巴细胞分离液注入密度梯度离心管，每管注入15mL。
（3）保持密度梯度离心管垂直，通过血清移液管将稀释的静脉外周血沿着管壁加入。PBMC样品会和隔板上方的分离液混合，但不影响分离效果。
（4）使用水平转子离心机，在开启离心机制动器的情况下，室温1200g离心10分钟。
（5）离心完成后，将密度梯度离心管中最上层不含细胞的血浆和D-PBS稀释液吸出，保留5 mL血浆用作效价检测。
（6）缓慢吸出包含淋巴细胞的上层稀释液至新的无菌离心管中，添加1倍体积的D-PBS，室温1000g离心10分钟洗涤细胞。
（7）离心完成后，弃去上清，将底部沉淀得到的PBMC置于-80℃超低温冰箱冻存。
噬菌体表面展示文库构建流程介绍
噬菌体表面展示文库构建流程包括：总RNA提取、反转录、PCR扩增、酶切与连接、电转化TG1感受态细胞、到最后的收集文库。
图为噬菌体表面展示文库构建流程示意
噬菌体表面展示文库构建——实验过程简述
（1）总RNA提取：合并全部提取得到的PBMC，使用柱吸附法提取总mRNA；
（2）反转录：以提取得到的总mRNA为模板，反转录得到cDNA ；
（3）PCR：使用适当的DNA引物，以上述cDNA为模板，经聚合酶链式反应（PCR）扩增得到羊驼免疫球蛋白IgG2和IgG3的VHH片段，即纳米抗体的DNA片段 ；
（4）酶切与连接：①载体酶切：双酶切制备线性化的噬菌体表面展示筛选载体DNA质粒； ②片段酶切：双酶切VHH的DNA片段； ③连接载体与片段：使用T4 DNA连接酶连接酶切后的载体与片段，得到完整的VHH噬菌体表面展示筛选质粒文库，即VHH－ｐIII融合蛋白表达载体质粒文库。其中，ｐIII是存在于噬菌体表面鞭毛上的蛋白质；
（5）电转化TG1感受态细胞：将DNA连接产物经电转化方法，转化至TG1大肠杆菌感受态细胞，共电转96份连接产物；
（6）收集文库：适当培养收集后的全部菌落，即为免疫羊驼的纳米抗体文库。期间使用梯度稀释法计量电转后之后、培养前的文库大小，约1.56×109cfu.
（1）从文库中随机挑取不少于48个微生物单克隆，37℃培养过夜后，提取DNA质粒、进行Sanger测序。（2）将全部测序结果进行翻译后得到48条正确、有效的纳米抗体序列（见附件），其中包括48种完全不同的CDR3区域（如图示）。
图示：48条测序结果的CDR3区域氨基酸序列比对
片段插入率测试
（1）对上述48个微生物单克隆的VHH片段进行PCR扩增；（2）对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，评估VHH片段插入率
图示：48条VHH基因片段扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析结果
从电泳分析结果来看，48个微生物单克隆中有45个可以较好地PCR扩增出VHH基因片段，另有3个单克隆无法经PCR扩增。考虑到上文VHH片段的Sanger测序全部正确，此处3个单克隆的VHH片段无法扩增属人为实验误差，不影响对问题多样性的评价。