一、抗原制备及羊驼免疫
靶点：
GLP1R-胰高血糖素样肽1型受体
Glucagon-like peptide 1 receptor
使用稳定表达GLP1R的HEK293细胞株作为抗原
抗原形式：稳定表达GLP1R的细胞膜提取物
细胞数量：3*108个细胞
免疫次数：四次免疫
GLP1R 稳定表达细胞系
| 稀释比例 | 免疫后血清 | 免疫前血清 | ||||
| 100 | 1.829 | 1.833 | 1.841 | 0.211 | 0.158 | 0.162 |
| 400 | 1.723 | 1.75 | 1.705 | 0.147 | 0.135 | 0.134 |
| 1600 | 1.455 | 1.329 | 1.337 | 0.088 | 0.092 | 0.085 |
| 6400 | 0.722 | 0.659 | 0.671 | 0.064 | 0.07 | 0.066 |
| 25600 | 0.297 | 0.247 | 0.233 | 0.066 | 0.075 | 0.066 |
| 102400 | 0.15 | 0.18 | 0.19 | 0.065 | 0.068 | 0.069 |
| 409600 | 0.055 | 0.068 | 0.079 | 0.074 | 0.071 | 0.064 |
| 1638400 | 0.055 | 0.061 | 0.058 | 0.057 | 0.064 | 0.065 |
二、噬菌体文库构建
电转化后文库总量：约9.00×108 cfu 。电转化后、扩增前留取的微量样本，扩增培养后从中随机挑取48个单克隆，进行下述实验：
PCR评估噬菌体载体片段插入率：使用特异性引物PCR扩增48个单克隆的VHH基因片段，琼脂糖凝胶电泳发现其中4个单克隆未正确插入VHH基因片段。
片段插入率：44/48 × 100% = 91.67%
Sanger测序评估序列多样性
获得DNA序列后，翻译为氨基酸序列，剔除测序失败、无效、重复的序列，使用MAFFT进行多序列比对后，最终获得38条CDR3区域完全不同的VHH片段。
文库CDR3多样性：9.00×108 ×38/48 = 7.125×108 cfu
三、噬菌体表面展示筛选
第一轮初筛：共挑取了4块96孔板的微生物单克隆进行流式细胞分析筛选，其中包括大量非特异性克隆。详细实验数据见下页图。
第一轮筛选流式检测结果
第二轮初筛：共挑取了4块96孔板的微生物单克隆进行流式细胞分析筛选，其中包括大量阳性克隆。详细实验数据见下页图。
第二轮筛选流式检测结果
结论：第一轮完全没有阳性单克隆，第二轮筛选共得到近300个阳性单克隆。
注：使用瞬时表达GLP1R的HEK293T细胞做检测，流式结果分析阳性结果为不规则双峰图形。标红点的结果为初步阳性结果。
四、Sanger测序获得阳性VHH序列
- 将上述近300个单克隆进行Sanger测序，共得到260条有效的VHH基因序列。
- 经过翻译后，剔除错误的、重复的，最终得到52条序列不重复的VHH基因序列。
- 将52株单克隆纳米抗体进行重组表达纯化后，流式细胞分析确认、检测纳米抗体与GLPR1的亲和力，最终得到47株有效的纳米抗体
- 使用GLP1R稳定表达细胞系检测阳性单克隆纳米抗体结合GLP1R的情况。
五、单克隆纳米抗体结合GLP-1R流式检测结果
不同稀释比例检测结果
1mg/ml-起始按照1:400（2.5ug/ml），2倍稀释