本案例共有羊驼免疫、噬菌体文库构建、噬菌体表面展示筛选，以及Sanger测序获得阳性VHH序列四个步骤。

一、羊驼免疫：使用纯化的蛋白IL-18对Alpaca进行动物免疫

稀释比例 免疫后血清 免疫前血清
 500 1.429 1.43 1.367 0.263 0.156 0.105
1500 1.333 1.474 1.438 0.169 0.204 0.224
4500 1.046 1.097 1.001 0.095 0.076 0.087
13500 0.963 0.956 1.105 0.068 0.068 0.061
40500 0.893 0.775 0.874 0.067 0.067 0.072
121500 0.361 0.265 0.369 0.066 0.068 0.073
364500 0.061 0.05 0.06 0.075 0.075 0.06
1093500 0.059 0.064 0.065 0.054 0.069 0.070

 

 二、噬菌体文库构建

电转化后文库总量：约7.30×108 cfu 。电转化后、扩增前留取的微量样本，扩增培养后从中随机挑取48个单克隆，进行下述实验：

PCR评估噬菌体载体片段插入率 使用特异性引物PCR扩增48个单克隆的VHH基因片段，琼脂糖凝胶电泳发现其中4个单克隆未正确插入VHH基因片段。

片段插入率：44/48 × 100% = 91.67%

Sanger测序评估序列多样性

获得DNA序列后，翻译为氨基酸序列，剔除测序失败、无效、重复的序列，使用MAFFT进行多序列比对后，最终获得38条CDR3区域完全不同的VHH片段（见下图）。

文库CDR3多样性：7.30×108 ×38/48 = 5.78×108 cfu

 三、噬菌体表面展示筛选

第一轮初筛：共挑取了4块96孔板的微生物单克隆进行ELISA筛选，详细实验数据见下表格。

结论：第一轮初筛获得5个潜在阳性单克隆

plate 1

/ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0.0707 0.0735 0.0791 0.0756 0.0751 0.0728 0.0735 0.074 0.0714 0.0746 0.0717 0.0799
B 0.1635 0.0763 0.075 0.0823 0.0808 0.0803 0.0746 0.0751 0.0773 0.0769 0.0706 0.0707
C 0.0741 0.0748 0.0747 0.0758 0.0887 0.0835 0.0766 0.0759 0.0753 0.0778 0.0735 0.0717
D 0.0714 0.0777 0.0791 0.0749 0.0783 0.0782 0.0773 0.0773 0.0776 0.0806 0.0759 0.0716
E 0.0738 0.0752 0.074 0.077 0.0743 0.0748 0.0762 0.0786 0.0758 0.0756 0.0788 0.0746
F 0.0795 0.0811 0.0819 0.0738 0.0827 0.0773 0.0771 0.0769 0.0731 0.0808 0.074 0.074
G 0.0734 0.0729 0.0732 0.0756 0.077 0.0743 0.0801 0.0799 0.0805 0.0808 0.0731 0.0642
H 0.0692 0.0729 0.0732 0.0741 0.0785 0.0793 0.0795 0.0778 0.0739 0.0731 0.0735 0.1851

 

plate 2

/ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0.0712 0.0788 0.0778 0.0757 0.0766 0.0762 0.0822 0.0822 0.0764 0.077 0.0739 0.0883
B 0.0784 0.0754 0.0861 0.0732 0.0767 0.0921 0.077 0.0837 0.0773 0.0735 0.074 0.0786
C 0.0864 0.0818 0.0775 0.078 0.078 0.079 0.0781 0.0771 0.0825 0.0782 0.0804 0.0782
D 0.0784 0.1443 0.0788 0.0837 0.0801 0.0771 0.075 0.0814 0.0818 0.0971 0.0818 0.0761
E 0.0726 0.0778 0.0784 0.0843 0.0889 0.078 0.0781 0.0779 0.0772 0.0758 0.0757 0.0777
F 0.0769 0.079 0.0789 0.0827 0.0811 0.0783 0.0803 0.0836 0.0883 0.0846 0.0828 0.0817
G 0.0722 0.0792 0.0788 0.0767 0.0819 0.0839 0.0777 0.0766 0.0778 0.083 0.0753 0.0704
H 0.0735 0.0768 0.0798 0.0805 0.0756 0.0758 0.0738 0.0768 0.0807 0.0832 0.0812 0.189

 

plate 3

/ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0.0694 0.0757 0.0786 0.0755 0.0804 0.0745 0.0788 0.0774 0.0825 0.0756 0.0775 0.0763
B 0.0702 0.0786 0.0798 0.0794 0.0814 0.0813 0.0822 0.0818 0.0814 0.0775 0.0771 0.076
C 0.0709 0.0814 0.0784 0.086 0.0779 0.0786 0.0799 0.0776 0.0794 0.0761 0.075 0.076
D 0.0757 0.0799 0.0792 0.0802 0.0862 0.0799 0.0782 0.0791 0.0785 0.0839 0.08 0.0769
E 0.0716 0.0775 0.0754 0.0774 0.0847 0.0803 0.083 0.0758 0.0801 0.0791 0.0764 0.0802
F 0.0748 0.0772 0.0791 0.0804 0.0906 0.08 0.0808 0.0813 0.0784 0.0764 0.0808 0.0771
G 0.0738 0.0787 0.0787 0.08 0.082 0.0798 0.0815 0.0785 0.0816 0.0792 0.0761 0.071
H 0.073 0.082 0.0762 0.1198 0.0831 0.0814 0.0821 0.0787 0.0804 0.0753 0.0799 0.2075

 

第二轮初筛：共挑取了4块96孔板的微生物单克隆进行ELISA筛选（plate 05-08，每板另有2个对照克隆），详细实验数据见表格。

结论：第二轮初筛获得约90个潜在阳性单克隆

plate 05

/ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0.2861 0.0619 0.1553 0.0571 0.0697 0.1173 0.2654 0.0631 0.1353 0.0567 0.0676 0.0561
B 0.174 0.0606 0.0587 0.0583 0.063 0.1602 0.056 0.0586 0.0623 0.1347 0.0615 0.056
C 0.0613 0.0912 0.0566 0.2031 0.0758 0.0636 0.0978 0.0585 0.1514 0.1922 0.0553 0.0561
D 0.063 0.1056 0.098 0.0726 0.0943 0.0655 0.061 0.0656 0.0557 0.1594 0.0552 0.0607
E 0.0605 0.1982 0.0564 0.1177 0.0627 0.0672 0.0604 0.0769 0.0608 0.0617 0.0634 0.063
F 0.0596 0.0609 0.0579 0.0616 0.0588 0.0642 0.0574 0.058 0.0568 0.1712 0.0987 0.0556
G 0.0565 0.0783 0.0568 0.2033 0.0826 0.0711 0.0556 0.1341 0.0553 0.1082 0.0548 0.0559
H 0.0827 0.2919 0.091 0.2727 0.0567 0.1121 0.0568 0.2702 0.0873 0.255 0.056 0.251

 

plate 06

/ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0.0651 0.0566 0.0684 0.102 0.0653 0.0597 0.2466 0.0888 0.0683 0.2014 0.0899 0.0562
B 0.1529 0.0582 0.2096 0.057 0.0747 0.062 0.0555 0.0575 0.0657 0.0554 0.2129 0.055
C 0.0559 0.0596 0.2581 0.0582 0.0591 0.0569 0.1052 0.0566 0.0508 0.063 0.1112 0.0552
D 0.0972 0.2394 0.0759 0.0588 0.0582 0.0606 0.2575 0.0711 0.0555 0.0583 0.0557 0.0571
E 0.0579 0.0591 0.0578 0.0659 0.0974 0.0647 0.0575 0.2389 0.0557 0.0598 0.0582 0.0616
F 0.0591 0.0707 0.1009 0.0634 0.0777 0.0636 0.0592 0.0594 0.0572 0.0601 0.0648 0.0566
G 0.0574 0.1157 0.0565 0.0588 0.0554 0.1596 0.1966 0.0673 0.0539 0.1265 0.064 0.0552
H 0.0968 0.0674 0.0932 0.059 0.0571 0.0747 0.0819 0.0662 0.123 0.2302 0.1021 0.2622

 

plate 07

/ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0.1742 0.0746 0.1105 0.0609 0.0627 0.0826 0.0851 0.0568 0.0548 0.1102 0.0547 0.0555
B 0.0589 0.1995 0.1255 0.1161 0.0573 0.1876 0.056 0.2677 0.055 0.0582 0.055 0.0552
C 0.0593 0.0579 0.0578 0.0703 0.0557 0.2025 0.0556 0.0669 0.0611 0.0789 0.0543 0.0573
D 0.0587 0.0983 0.1659 0.1289 0.0583 0.1227 0.0566 0.1582 0.0581 0.0674 0.0563 0.0657
E 0.0572 0.1654 0.0576 0.0716 0.2404 0.0701 0.0605 0.0668 0.2287 0.0694 0.0607 0.0641
F 0.059 0.0595 0.0618 0.0624 0.2407 0.0595 0.0716 0.106 0.0816 0.0667 0.0593 0.0594
G 0.0562 0.129 0.0572 0.1867 0.1882 0.0841 0.0554 0.071 0.0572 0.0628 0.0751 0.0562
H 0.0589 0.1726 0.0578 0.0689 0.0575 0.0637 0.0578 0.0673 0.0607 0.0664 0.0586 0.2658

 

plate 08

/ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0.0583 0.0592 0.0575 0.0929 0.0585 0.1161 0.232 0.119 0.0644 0.0592 0.0568 0.1757
B 0.0556 0.124 0.0803 0.0577 0.0546 0.071 0.0571 0.0702 0.0573 0.0599 0.0591 0.1539
C 0.0794 0.0621 0.056 0.1091 0.0678 0.0594 0.2024 0.0608 0.0676 0.061 0.0579 0.0778
D 0.0661 0.067 0.0584 0.0731 0.1041 0.1036 0.0695 0.0728 0.0735 0.0703 0.1152 0.1019
E 0.0659 0.2459 0.0572 0.0663 0.0555 0.1708 0.0579 0.0677 0.0577 0.0778 0.0623 0.1592
F 0.0606 0.0586 0.0587 0.0571 0.0721 0.227 0.0957 0.0634 0.1765 0.0702 0.0636 0.0607
G 0.054 0.0666 0.0564 0.0617 0.0567 0.1463 0.0576 0.0697 0.0564 0.2615 0.1307 0.06
H 0.1496 0.1021 0.0728 0.0785 0.0577 0.0726 0.0561 0.1611 0.0783 0.1801 0.0595 0.2327

 

第一、二轮复筛：将初筛中获得的90余个单克隆挑选出来重新进行ELISA筛选（另有2个对照克隆），详细实验数据见下表格。

结论：复筛后保留32个潜在的阳性单克隆纳米抗体

/ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0.1263 0.0858 0.0863 0.0738 0.085 0.1102 0.0838 0.2779 0.2733 0.1157 0.0818 0.1336
B 0.1526 0.1888 0.0704 0.1205 0.0717 0.0801 0.0805 0.0833 0.0746 0.0753 0.2528 0.0771
C 0.0629 0.1208 0.0774 0.0876 0.2369 0.0768 0.1459 0.0728 0.114 0.0646 0.2313 0.0573
D 0.0796 0.113 0.0718 0.0755 0.1654 0.0958 0.0693 0.0693 0.0682 0.1419 0.0781 0.0584
E 0.0804 0.0692 0.0772 0.1529 0.068 0.0606 0.103 0.0683 0.0705 0.0798 0.1797 0.058
F 0.1057 0.1261 0.0785 0.0732 0.1378 0.0778 0.0995 0.1877 0.0657 0.3154 0.1249 0.0576
G 0.0908 0.079 0.0626 0.0795 0.1156 0.0841 0.0607 0.0888 0.0757 0.3253 0.1943 0.0612
H 0.0638 0.0943 0.094 0.0758 0.095 0.1342 0.2676 0.0871 0.093 0.0942 0.0728 0.2256

 

 四、Sanger测序获得阳性VHH序列

  • 将上述近32个单克隆进行Sanger测序，共得到32条有效的VHH基因序列。
  • 经过翻译后，剔除错误的、重复的，最终得到23条序列不重复的VHH基因序列。
  • 将23株单克隆纳米抗体进行重组表达纯化后，ELISA检测纳米抗体与IL18的亲和力，最终得到19株有效的纳米抗体