高亲和力F5纳米抗体的发现

       在宫颈癌的发展机制中，E6/E7蛋白通过降解p53等抑癌蛋白来促进肿瘤发展，由于其为胞内蛋白，使得传统抗体难以靶向。但E6蛋白的某些片段，如E6_29-38和E7_11-19可通过主要组织相容性复合体I类（MHC-I，即HLA-A*02:01）呈递至细胞表面，因此该pMHC恰好成为了纳米抗体的理想靶点。

       为了筛选出高亲和力的纳米抗体，研究团队通过免疫骆驼并提取了外周血单核细胞(PBMCs)构建了噬菌体展示文库，以E6_29-38与pMHC的复合物为靶标，通过多轮结合-洗脱-扩增，富集特异性克隆筛选出F5和G9两个纳米抗体。

       通过ELISA与BLI测定发现两个纳米抗体均对E6-pMHC复合物有特异性结合能力，亲和力与多数TCR（天然T细胞受体）接近。在通过流式细胞检测后显示，F5与细胞表面E6-pMHC复合物的结合效率显著高于G9，且F5对CaSki和SS4050细胞有高结合力，呈剂量依赖性，无明显脱靶结合。这一发现为进一步的研究提供了良好前提。

图1：通过噬菌体展示技术筛选靶向E6-pMHC的纳米抗体

F5 CAR-T细胞：体外高效杀伤与体内抑瘤

       为了最大化激活T细胞的杀伤能力与持久性，研究团队将F5纳米抗体整合至第二代CAR结构中，其抗原识别域以F5纳米抗体直接靶向E6-MHC复合物；铰链与跨膜区采用CD8α分子，确保CAR-T锚点的稳定性与信号传递功能；共刺激域引入4-1BB（CD137），通过激活NF-κB通路延长T细胞存活时间并抑制其衰亡进程；激活域依赖 CD3ζ 链触发 T 细胞杀伤信号级联反应；安全开关则通过截短的 EGFR来实现体内追踪与可控清除。

       体外实验显示，F5 CAR-T细胞对HPV-16宫颈癌细胞展现出精准且高效的杀伤能力。其特异性识别E6-pMHC复合物阳性细胞（如 293E6、CaSki、SS4050），在效靶比（E:T）为12.5:1时对CaSki细胞的杀伤率超60%，显著优于传统TCR-T疗法（同等条件下杀伤率仅30%）。共培养实验证实，F5 CAR-T通过释放IL-2、IFN-γ、颗粒酶A/B等效应分子，激活NFAT和NF-κB双信号通路，但未引发过度炎症反应。

图2：NFAT 和 NF-κB 均参与基于 F5 的 CAR-T 细胞激活

       在小鼠模型中，F5 CAR-T的疗效与安全性得到验证：单次静脉输注后，治疗组肿瘤体积较对照组（CD19 CAR-T或未改造T细胞）缩小 70%，有效性持续至治疗后第7周。治疗6周后，脾脏分离的CAR-T细胞仍保留杀伤活性，且未观察到体重下降或器官病理损伤，证明其低脱靶毒性与优异安全性。这一设计为HPV相关实体瘤的精准治疗提供了创新策略。

图3：F5 CAR-T细胞对HPV16+宫颈癌细胞的特异性杀伤及细胞因子释放谱

机制解析：F5 纳米抗体的精准识别与 HLA 限制性突破

       进一步研究中，研究团队通过系统性丙氨酸扫描技术揭示F5纳米抗体结合的核心区域为肽段C端的第5、6、9位残基（Ile、Leu及Val），其中任何一个位点的突变均导致结合完全丧失，而第8位（Glu）突变仅部分降低亲和力。值得注意的是，第2、4、7位残基的突变虽不影响F5结合，但会破坏pMHC对肽段的稳定呈递，表明这些位点对复合物构象至关重要。

       分子对接模拟显示，F5纳米抗体的FR2与CDR3协同嵌入HLA分子的α螺旋沟槽，其中CDR3直接接触肽段C端，而FR2与HLA的保守区域形成氢键网络。这种结合模式与天然TCR高度相似，提示F5纳米抗体可模拟T细胞的免疫识别过程。

       然而，F5的pMHC限制性限制了其广泛应用。研究团队提出多维度解决方案：首先开发双特异性纳米抗体，同时靶向E6肽段与HLA的保守区域（如β2微球蛋白），实现跨HLA亚型识别；其次通过基因编辑技术构建通用型CAR-T（UCAR-T），敲除患者T细胞的HLA基因并引入通用CAR，避免免疫排斥；此外联合使用E6_29-38肽段疫苗增强患者自身免疫应答，与CAR-T形成协同效应。

图4： F5 CAR-T 在宫颈癌小鼠模型中的抗肿瘤效果及持久性分析

研究总结及未来方向

       总的来说，TCR模拟抗体（TCRm）与CAR-T的结合是癌症免疫治疗技术的创新升级。TCRm的高亲和力可结合pMHC隐蔽表位，减少脱靶效应，还可同时激活双信号通路，持续刺激T细胞活化并明显增强针对肿瘤细胞的杀伤能力，且毒副作用更低，安全性得到显著增强；同时，纳米抗体小分子体积的优势能克服实体瘤微环境，提升CAR-T在实体瘤细胞中的穿透能力，TCRm的引入使CAR-T能够靶向E6-pMHC复合物，解决了传统抗体无法触及细胞内抗原的难题。

       F5纳米抗体的成功不仅为宫颈癌患者带来希望，更标志着纳米抗体技术在癌症治疗领域的全面突破，有望成为对抗癌症、病毒感染等重大疾病的“万能钥匙”。研究团队也表明在未来将聚焦于结构优化与临床转化：通过冷冻电镜（Cryo-EM）解析F5与 E6-pMHC复合物的高分辨率结构，指导纳米抗体的人源化改造以降低免疫原性；同时探索与PD-1抑制剂联用，逆转肿瘤微环境中的T细胞耗竭，推动F5 CAR-T疗法的临床应用。

 参考文献：Duan, Z. et al. (2024). CAR-T cells based on a TCR mimic nanobody targeting HPV16 E6 exhibit antitumor activity against cervical cancer. Molecular Therapy: Oncology.