由于神经节周围存在类似血脑屏障的血神经屏障，由紧密连接的血管内皮细胞和神经周围细胞构成，限制了药物（尤其是大分子或亲水性药物）的渗透，且神经元会通过转运蛋白主动将药物排出神经节，进一步导致药物在神经节内的浓度不足。同时，潜伏期的HSV以环状附加体形式存在于神经元细胞核内，仅表达少量非编码RNA，不进行活跃复制，也不产生病毒蛋白，致使其他小分子药物无法有效地靶向病毒。
对此，中国科学技术大学科研团队成功研发出一种双特异性纳米抗体Nb14-32-Fc，其针对HSV的gD蛋白，展现了前所未有的抗病毒潜力。并研究发表于《Nature communications》，为HSV根治性难题带来了新的希望。
纳米抗体的筛选
研究人员将HSV-2 gD蛋白作为抗原免疫骆驼，并提取外周血淋巴细胞构建噬菌体文库。而后，采用“病毒颗粒-抗原表位”双重筛选，先用灭活HSV-2病毒吸附特异性纳米抗体，再用gD蛋白竞争性洗脱，经过4轮筛选获得13株阳性克隆，其中Nb14-Fc和Nb32-Fc在体外中和实验的中和效率>90%，且结合亲和力极高(EC50分别为0.04 nM和0.09 nM)，与传统单抗E317(KD=0.5nM)相比提升10倍以上。
在通过竞争性ELISA实验后发现，在增加了Nb32浓度的情况下并未影响Nb14-Fc的结合能力，这表明Nb14与Nb32靶向结合的表位并非相同且重叠的。利用晶体结构解析显示，Nb32结合Nectin-1受体结合域，而Nb14结合gD蛋白的N-A’interloop区域(P47、Q49等位点)，与Nb32的结合表位并不重叠，这意味着gD蛋白的一个新的中和表位被发现，为多靶点抗体设计提供有效的理论依据。
图1：Nb14及Nb32具有中和作用的结构基础
工程化设计的双特异性纳米抗体
在此基础上，研究人员通过柔性连接肽（GGGGS重复序列）将Nb14与Nb32的VHH结构域与人IgG1的Fc段进行串联，构建形成“Y”型分子结构的双特异性抗体Nb14-32-Fc。在利用SPR进行亲和力检测分析后发现Nb14-32-Fc对HSV-2 gD的KD值达24.1 pM，比Nb32-Fc的结合亲和力高出2倍。
在中和活性测试的体外实验结果显示，Nb14-32-Fc对HSV-1的病毒附着前的IC50值为0.46nM，附着后为0.39nM；对HSV-2的病毒附着前的IC50值为0.25nM，附着后为0.24nM。这表明Nb14-32-Fc对HSV-1和HSV-2的病毒附着前后两个阶段均有显著的中和能力，这解决了传统抗体仅能阻断附着前阶段的局限性。
在Vero细胞单层实验中，Nb14单抗组细胞间传播抑制率为60%，Nb32组的抑制率仅45%，而Nb14-32-Fc组的细胞间传播抑制率超90%，病毒感染灶面积仅为对照组的12%，进一步证实了双特异性纳米抗体的有效性。
图2：通过工程化改造后的Nb14-32-Fc结构及其中和能力
Nb14-32-Fc的动物模型的体内验证
为进一步确认Nb14-32-Fc的有效性，研究人员分别建立了三种不同的小鼠模型来验证Nb14-32-Fc的中和效果。分别HSV-1颅内感染模型来模拟疱疹性脑炎、HSV-2阴道感染模型来评估生殖器疱疹保护效果、耐药株角膜感染模型：测试对抗阿昔洛韦耐药株的能力，并设计了0.1mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg三个梯度剂量组，对照组则采用E317(10mg/kg)、阿昔洛韦(50mg/kg)进行对比实验。
结果显示，在HSV-1颅内感染模型中，1mg/kg的Nb14-32-Fc组小鼠存活率达80%，显著高于E317组小鼠的30%存活率和阿昔洛韦组小鼠的40%存活率；在HSV-2阴道感染模型中，1mg/kg Nb14-32-Fc组小鼠的产仔存活率提升至95%，且该剂量组小鼠体内的病毒载量较对照组降低了3个log值；而在阿昔洛韦耐药株(KOS-V204G)的对照试验中，Nb14-32-Fc 0.5mg/kg治疗组的角膜溃疡愈合速度比阿昔洛韦组快2倍。
图3：HSV-1颅内感染模型对照试验（左） 图4：HSV-2阴道感染模型对照试验（右）
从HSV治疗到病毒潜伏微环境
该研究不仅重塑了HSV的治疗格局，同时也为HSV的根治性难题带来了新的可能，从1977年阿昔洛韦问世到2023年纳米抗体的突破性进展，HSV治疗经历了46年的技术蛰伏。如今，Nb14-32-Fc不仅以“双表位阻断+免疫激活”的创新机制打破了传统疗法的局限，更开创了“靶向病毒潜伏微环境”的治疗新思维。随着临床转化的加速，我们有理由相信，这场由纳米抗体引领的医学革命，终将让全球近半数人口的HSV感染者摆脱“终身感染反复发作”的阴影，迎来真正治愈的曙光。
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