TRIB2其作为假激酶家族的重要成员，早已被证实与急性髓系白血病(AML)的发生发展密切相关，它可以与E3泛素酶COP1相互作用来促进关键转录因子C/EBPα通过蛋白酶体途径降解，也可以改变C/EBPα的空间结构，使其转化为致癌形式，最终阻断骨髓细胞分化，诱发白血病。然而，尽管TRIB2的致癌机制已被初步揭示，但其结构与功能的关系仍存在诸多谜团。传统研究发现，TRIB2蛋白极不稳定，在体外极易降解或聚合，难以获得高质量的结构数据；同时，TRIB家族的TRIB1、TRIB2、TRIB3结构相似，常规研究工具难以区分，严重阻碍了对TRIB2特异性功能的探索。
在此背景下，由新西兰奥塔哥大学与多所大学的联合研究团队利用纳米抗体首次解析了TRIB2的激活态结构，还开发出能精确调控该蛋白的纳米抗体工具。此研究发表于Cell子刊《Structure》，为癌症靶向治疗带来全新可能。
筛选特异性结合TRIB2的纳米抗体
作为潜在的急性髓系白血病治疗性靶点，TRIB2的“可药性”尚未被验证。如何精准靶向TRIB2而不影响其他家族成员？其激活状态下的结构特征是什么？面对这些问题，研究团队采用酵母表面展示技术构建了庞大的纳米抗体库。研究团队将TRIB2包含假激酶结构域和COP1结合基序的功能片段作为靶点，通过多轮磁珠分选(MACS)和荧光激活细胞分选(FACS)，逐步富集能与TRIB2结合的纳米抗体。
为提高筛选精度，研究团队对TRIB2进行了FITC和AlexaFluor647的双重荧光标记，并不断降低浓度，最终通过下一代测序锁定了15个高丰度候选序列。在经过表达纯化和验证后，3种纳米抗体(Nb4.101、Nb4.103、Nb4.105)脱颖而出。它们不仅能与TRIB2稳定结合，还通过尺寸排阻色谱验证与TRIB2的结合力，证明纳米抗体显著提升了TRIB2的稳定性。
图1：纳米抗体的筛选与初步表征
纳米抗体“冻结”TRIB2，首揭激活态面纱
在获得稳定的TRIB2-纳米抗体复合物后，研究团队将TRIB2亲和最高的纳米抗体Nb4.103通过坐滴法进行结晶筛选，在优化结晶条件后，成功获得了高质量晶体，并利用MX2光束线同步辐射装置收集了衍射数据，最后通过分子置换法解析出2.7Å分辨率的三维结构。
结构显示，Nb4.103精准地插入TRIB2的N端叶，通过互补决定区与TRIB2的β1-β3链形成紧密相互作用：CDR2的Thr56和CDR3的Tyr108形成氢键，CDR1的Tyr33则通过疏水作用锚定核心界面。
更重要的是，这一结构揭示了TRIB2的“激活态”构象：其激活环完全有序，αC螺旋处于开放状态，与TRIB1结合C/EBPα时的构象高度相似，这意味着Nb4.103识别的正是TRIB2发挥功能时的关键状态，为研究其作用机制提供了“快照”。
图2：TRIB2-Nb4.103复合物结构揭示激活态
TRIB2与TRIB1的结构差异分析
最后，研究团队通过比对TRIB2与已知的TRIB1结构，分析了二者假活性位点的氨基酸组成、静电特性及小分子结合潜力，并用分子对接模拟了EGFR抑制剂与TRIB2的相互作用。结果显示TRIB2的假活性位点呈现更强的电负性，而TRIB1则为电正性，这解释了为何二者对小分子抑制剂的响应不同。例如，阿法替尼可共价修饰TRIB2的Cys104，但需通过构象变化避开空间位阻。这一发现为设计TRIB2特异性抑制剂提供了结构基础。
图3：TRIB2与TRIB1伪活性位点的电荷特性差异
纳米抗体的特异性与功能验证
为确认纳米抗体的实用性，团队开展了系列验证实验。通过等温滴定量热法(ITC)测定亲和力，ELISA检测对TRIB1/2/3的交叉反应性，SEC-SAXS分析溶液中的聚合状态，以及ITC检测纳米抗体对TRIB2与C/EBPα结合的影响。
等温滴定量热法(ITC)测得三种纳米抗体对TRIB2的解离常数均在纳摩尔级。ELISA结果显示，Nb4.101和Nb4.103对TRIB2的结合信号是TRIB1/TRIB3的15-20倍，其特异性源于结合表位上的关键差异残基，结果充分展示了纳米抗体超高的亲和力与特异性。
图4：纳米抗体的结合特性与特异性
在对纳米抗体功能性验证时，竞争性ELISA显示Nb4.101与Nb4.103结合表位重叠，而Nb4.105结合在另一区域。而通过SEC-SAXS分析发现，Nb4.103能诱导TRIB2形成“面对面”二聚体复合物，而Nb4.101虽结合相同表位却不促进二聚化。进一步实验证实，TRIB2二聚化直接阻碍其结合致癌底物C/EBPα。ITC实验显示，当Nb4.103存在时，二聚化的TRIB2与C/EBPα的结合亲和力下降3倍，而Nb4.101无此效应，结果说明Nb4.103不仅是结构探针，还可通过稳定二聚体抑制TRIB2的致癌功能。
图5：纳米抗体结合表位差异与诱导二聚化能力（左）Nb4.103诱导二聚化抑制C/EBPα结合（右）
从基础机制到癌症治疗的跨越
该研究首次揭示激活态结构，为理解TRIB2如何识别底物和招募COP1提供了精确模板。同时，研究揭示了TRIB1/2功能分化的结构基础，二者虽均可降解C/EBPα，但伪活性位点电荷特性、动态性及潜在底物谱的差异，暗示它们在白血病发生中可能扮演非冗余角色。纳米抗体将成为剖析二者独特功能的关键工具。不仅于此，该研究确认了“开放构象”是功能活性态，而位于伪活性位点深处的Cys104可能是构象转换的关键节点。这解释了为何靶向EGFR的共价抑制剂能意外降解TRIB2，为设计更优TRIB2选择性共价抑制剂指明方向，为白血病等癌症带来治疗新希望。
这项研究是纳米抗体技术在攻克困难靶点领域的一次里程碑式胜利。面对传统方法难以应对的内在无序蛋白、构象动态变化的蛋白或假激酶靶点，纳米抗体凭借其独特优势正成为不可或缺的工具。