在此背景下，“猝灭体”(Quenchbodies)技术凭借“混合-读取”的均质检测优势脱颖而出。但现有猝灭体技术存在基于传统抗体尺寸大、表达难等关键短板，为突破这一限制，来自澳大利亚伍伦贡大学、法国巴黎高等物理化学学院等机构的研究团队，展开了针对纳米抗体基猝灭体的优化研究，成果发表于《Communications Biology》。研究团队通过分子动力学模拟与理性设计，精准识别出纳米抗体互补决定区(CDRs)中调控荧光猝灭的关键色氨酸残基，构建了优化的纳米抗体支架；以该支架为基础，经体外定向进化筛选，开发出针对IL-6的高性能猝灭体——荧光增幅提升至1.5-2.4倍，检测限低至1-2 nM，且可在2-3周内快速开发针对不同蛋白质靶点的传感器，为临床诊断、环境监测等领域提供了通用型检测平台。
机制解析：锁定纳米抗体CDR色氨酸的核心作用
要优化猝灭体性能，首先需明确其荧光调控机制。研究团队选择两类具有高分辨率晶体结构的凸面结合型纳米抗体——麦芽糖结合蛋白(MBP)结合型(PDB ID:5M14)与溶菌酶结合型(PDB ID:1ZVH)作为研究模型，通过全原子分子动力学(MD)模拟，分析荧光团(TAMRA)与纳米抗体残基的相互作用。
模拟结果显示：在未结合抗原时，MBP结合型纳米抗体的CDR色氨酸(W101、W110、W115)与荧光团的距离≤10 Å的时间占比达 70.7±18.7%，此时荧光被高效猝灭；而结合MBP抗原后，该占比骤降至0.1±0.2%，荧光团因空间位阻脱离色氨酸作用范围，实现“去猝灭”。这一结果首次证实：纳米抗体CDR区域的色氨酸残基，是调控荧光猝灭与恢复的核心开关。
图1：淬灭体工作机制与分子模拟结果
支架优化：理性设计提升基础检测性能
基于机制解析，研究团队通过定点突变实验验证关键色氨酸的功能，并进一步优化支架结构。针对溶菌酶结合型纳米抗体，其CDR区域含三个色氨酸(W36、W103、W115)，其中W36深埋于β-折叠桶内部，无法与荧光团接触，而W103直接与溶菌酶结合、W115仅位于表面。将W103突变为酪氨酸(W103Y)后，猝灭体对溶菌酶的荧光增幅显著下降；反之，将CDR中的酪氨酸(Y110)突变为色氨酸(Y110W)，荧光增幅从野生型的1.3倍提升至1.7倍。
类似地，针对MBP结合型纳米抗体，敲除CDR关键色氨酸(W101、W110、W115)后，猝灭体完全失去荧光响应；而在引入Y59W突变后，荧光增幅提升至1.9倍。最终，团队构建出通用优化支架——在CDR2(W59)与CDR3(W101、W103、W110、W115)精准引入色氨酸，形成凸面分布的“猝灭中心”，使MBP与溶菌酶靶向猝灭体的检测限分别达4 nM与1 nM，EC50(半数有效浓度)分别为14 nM与7 nM，性能较传统纳米抗体基猝灭体提升30%-50%。
图2：色氨酸突变对荧光响应的影响
定向进化：开发IL-6高性能检测工具
为验证支架的通用性，研究团队以人炎症细胞因子IL-6为靶点，开展体外定向进化筛选。首先，通过TRIM寡核苷酸随机化优化支架的CDR区域，构建含多样变体的基因库，并融合SNAP标签实现“表型-基因型”连锁——每个基因变体与含苄基鸟嘌呤(BG)的树枝状DNA结合，在微滴中完成无细胞表达后，SNAP标签与BG共价连接，确保筛选到的活性变体可追溯其基因序列。
经5轮磁珠筛选与NGS测序，研究团队获得12个初始阳性变体，其中最优变体#1的荧光增幅达2.2倍，EC50为185 nM。研究人员利用SNAP-display技术针对CDR1和CDR3区域进行随机突变，构建了随机化CDR区的纳米抗体库，并通过微滴封装与体外筛选，最终得到变体#15与#35。#15的检测限低至1 nM，EC50降至20 nM；#35的荧光增幅达2.4倍，检测限为2 nM，且在50%人血浆中仍能保持稳定检测性能，为临床IL-6检测提供了高效工具。
图3：定向进化流程与IL-6淬灭体性能
在整个研究中，纳米抗体并非简单的检测载体，而是决定技术突破的核心要素，其独特优势贯穿从机制解析到应用开发的全流程。基于纳米抗体小分子体积与结构简单的优势，其CDR区域可直接暴露于表面，无需通过VH-VL界面间接调控荧光团，这一特性使其能通过CDR色氨酸直接与荧光团作用，避免了传统scFv/Fab基猝灭体因界面变构效应导致的调控效率低问题。且该研究中选择纳米抗体的凸面结合模式，可在结合蛋白质抗原时形成显著空间位阻，高效推动荧光团脱离色氨酸，实现“去猝灭”的精准调控。
其次，纳米抗体具有极高的稳定性与突变耐受性，这种特性使得纳米抗体具备极高的工程化改造潜力。研究团队通过工程化改造即可显著提升其性能，无需担心结构折叠异常。同时，由于纳米抗体的基因序列短，易于通过TRIM寡核苷酸实现CDR随机化，构建大容量基因库，可在短时间内完成从支架构建到靶点筛选的全流程，效率远高于传统抗体。
该研究不仅提供了一种高性能的纳米抗体淬灭体设计策略，更展示了计算机模拟、工程化设计与定向进化相结合在现代生物传感器开发中的强大潜力。未来，随着进一步优化与产业化推进，这类淬灭体有望成为下一代免疫检测技术的核心工具，推动精准医疗、体外诊断和环境监测等领域的发展。