近年来，大规模深度测序和结构生物学技术，特别是冷冻电镜(cryo-EM)的突破，为基于结构的药物研发提供了强大助力。LGR4 (Leucine-rich repeat-containing G protein-coupled receptor 4)因其在能量代谢和脂肪褐变中的关键作用，被遗传学研究证实为潜在的抗肥胖靶点。然而，由于其胞外结构域(ECD)表面特征，开发传统小分子拮抗剂面临巨大挑战。
在此背景下，由上海交通大学医学院附属瑞金医院、中国科学院上海药物研究所等机构联合开展的一项研究，成功解析了LGR4及其配体复合物的三维结构，并开发出一种能特异性阻断LGR4信号通路的纳米抗体NB21，为肥胖治疗提供了全新的解决方案。该研究成果已发表于国际权威期刊《Nature Communications》。
该研究成功解析了全长LGR4及其与RSPO2(FU)复合物的冷冻电镜结构，并筛选出能阻断LGR4与RSPO1/2结合的抑制性纳米抗体 NB21，并明确其复合物结构。NB21融合鼠IgG2 Fc段(NB21-mFc)在体外和体内均表现出显著抑制Wnt/β-catenin信号通路，增强米色脂肪细胞产热和线粒体呼吸，在体内促进白色脂肪棕色化，显著提升能量消耗，对高脂饮食和遗传型(ob/ob)肥胖均展现出显著的减重效果，为肥胖治疗提供了全新的靶向候选药物及结构基础。
LGR4及相关复合物的冷冻电镜结构解析
研究团队首先针对 LGR4 结构解析的技术瓶颈，设计了高亲和力纳米抗体NB52，并与幽门螺杆菌HopQ蛋白的胞外粘附结构域融合扩展为MB52，其作为结构研究的辅助工具，主要用于增大LGR4复合物的颗粒尺寸和优化取向。借助MB52的辅助，成功获得分辨率3.03Å的全长LGR4结构，其胞外域呈180度延伸弯曲的马蹄形，相对于膜层呈直立构象，7次跨膜结构域则与非活性状态的A 类GPCR结构相似。
为探究配体结合对LGR4构象的影响，团队进一步解析了LGR4与RSPO2(FU 结构域)复合物的冷冻电镜结构，分辨率达3.06Å。结果显示，LGR4与RSPO2(FU)以1:1比例结合，RSPO2通过FU2结构域结合于LGR4胞外域顶部的凹面，主要作用于LRR3-LRR7重复序列，通过盐桥、氢键及疏水作用形成稳定相互作用界面，掩埋约2200.96 Ų的溶剂可及表面积。对比发现，RSPO2结合仅使LGR4胞外域发生2.5度轻微旋转，未诱导其向活性构象转变。
图1：LGR4及其与RSPO2(FU)复合物的冷冻电镜结构
抑制性纳米抗体NB21的筛选与结构鉴定
基于LGR4靶向纳米抗体噬菌体展示文库，研究团队通过TOPFlash实验筛选出具有显著抑制活性的纳米抗体NB21。BLI实验证实，NB21对人LGR4胞外域的解离常数(KD)为1.12±0.04nM，对鼠LGR4的KD为0.82±0.01nM，亲和力高且具有种属交叉反应性，能有效竞争RSPO1/2与LGR4的结合位点。
随后，团队解析了LGR4-NB21复合物的冷冻电镜结构(分辨率 3.64Å)，发现NB21通过互补决定区(CDRs)结合于LGR4胞外域上部凹面，掩埋约2260.04Ų的溶剂可及表面积，其结合表位与RSPO1/2在LGR4上的结合位点高度重叠，这是NB21阻断配体结合的结构基础。进一步分析显示，NB21的K31与LGR4的D137、D161形成盐桥，Y32与D162形成氢键，R100与E228形成盐桥，这些关键相互作用残基在人鼠LGR4中完全保守，确保了其功能稳定性。
图2：LGR4-NB21复合物的结构分析
NB21-mFc的体外功能验证
为提升NB21的体内半衰期和生物利用度，研究团队构建了NB21-mFc融合蛋白。在体外实验中，用RSPO1处理小鼠皮下白色脂肪组织基质血管组分(SVFs)，会导致活性β-连环蛋白水平升高、核内积累增加，并激活经典Wnt信号通路靶基因；而加入NB21-mFc后，上述效应被显著抑制。
在米色脂肪细胞中，NB21-mFc以剂量依赖方式阻断RSPO1/2诱导的经典Wnt信号通路激活，同时上调产热基因的表达，增强线粒体呼吸功能，表明其能有效逆转RSPO1/2对米色脂肪产热的抑制作用，促进白色脂肪向棕色脂肪转化。
图3：NB21-mFc抑制Wnt信号通路并促进米色脂肪细胞转化
NB21-mFc的体内抗肥胖效果验证
为确认NB21-mFc在体内的抗肥胖效果，研究团队对饮食诱导的肥胖(HFD)小鼠模型采用0.2mg/kg，隔日一次，持续6周的方案进行腹腔注射NB21-mFc。经观察发现，NB21-mFc能显著减少野生型(WT)小鼠的体重增加和脂肪量，尤其是内脏白色脂肪组织(vWAT)和皮下白色脂肪组织(sWAT)重量降低，脂肪细胞体积减小，UCP1蛋白表达升高。代谢监测显示，NB21-mFc处理组小鼠能量消耗(EE)显著增加，并在急性和慢性冷暴露中增强产热能力。
图4：NB21-mFc增强能量消耗与冷诱导产热
在Lgr4基因敲除(Lgr4m/m)小鼠模型中，NB21-mFc促进产热和减轻肥胖的效果完全消失，表明其作用机制高度依赖于LGR4。尽管NB21可能与其他LGR家族成员(如LGR5/6)存在交叉反应，但通过基因敲低实验证实，NB21-mFc的代谢效益主要由LGR4介导。
图5：NB21-mFc通过LGR4依赖性机制促进脂肪褐变
在Leptin缺陷型(ob/ob)肥胖小鼠模型中，低剂量NB21-mFc处理即可显著降低体重、脂肪质量，并提高能量消耗。组织学与分子分析显示，其脂肪组织中UCP1表达上升，炎症因子水平下降，进一步支持其在严重肥胖模型中的治疗潜力。
图6：NB21-mFc在ob/ob小鼠中的抗肥胖效果
该研究不仅揭示了LGR4及其配体复合物的精细结构，还为肥胖治疗领域增添了一个新的靶点，更成功开发出具有治疗潜力的纳米抗体NB21，其在多个肥胖模型中表现出显著的减重能力，并有望成为下一代抗肥胖药物的重要候选，为全球肥胖患者带来新的希望。且该研究由我国科研团队主导，解析了关键靶点的核心结构，开发了具有自主知识产权的候选药物，提升了在该领域的国际竞争力，为我国生物医药产业的创新发展注入新动力。
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