由法国细胞整合生物学研究所及居里研究所等科研单位发表于《Molecular Therapy:Oncology》的研究中表明，研究团队通过实验筛选出VSV-G骨架优化突变（H22N和S422I），成功解决氨基端融合纳米抗体导致的功能缺陷。研究人员将靶向HER2受体的纳米抗体与优化后VSV-G融合，并引入K47Q或R354Q突变消除LDL-R结合能力，最终构建的嵌合体可使伪型VSV（VSVΔG-GFP）和慢病毒特异性靶向感染HER2阳性细胞，为HER2阳性肿瘤的靶向溶瘤治疗与基因治疗提供了高效、安全的技术平台，也为其他靶点的靶向治疗研发奠定基础。

初始嵌合体构建与骨架优化突变

       研究团队首先构建了靶mCherry的嵌合糖蛋白G_C11，他们将C11纳米抗体通过QF二肽和GGGGS×2柔性连接肽，插入VSV-G信号肽与胞外域之间。通过转染HEK293T细胞检测发现，与野生型VSV-G（VSV-G_WT）相比，G_C11在细胞表面的表达量显著降低，仅为VSV-G_WT的53±23%。

       随后的伪型病毒实验进一步证实其功能缺陷：G_C11整合到VSVΔG-GFP包膜的效率低于VSV-G_WT，且伪型病毒的感染滴度比VSV-G_WT低1.3 Log₁₀。这表明，纳米抗体直接融合于VSV-G氨基端会严重影响其正常功能。

       为解决上述问题，研究团队开展实验进化：将G_C11基因替换VSV基因组中的G基因，构建重组病毒rVSV-G_C11，在BSR细胞中连续传代并监测病毒滴度与基因突变情况。传代结果显示，第4代病毒中出现了S422I突变，此时病毒滴度略有提升；第7代出现第二个突变H22N，与S422I形成组合，导致病毒滴度大幅提升，病毒滴度从初始的～10⁵ pfu/ml 飙升至～10⁷ pfu/ml；传至第10代，病毒基因组中仅保留H22N和S422I双突变，感染后16小时的终点滴度稳定在～10⁸ pfu/ml。这表明两个突变对恢复嵌合体功能具有协同增效作用，该双突变组合被命名为G_C11-opt，同时也被确定为VSV-G骨架的关键优化突变。

图1：VSV-G骨架优化的核心实验与结果

优化突变功能验证与机制探究

       为明确双突变的作用，研究团队从多维度开展验证。表面表达实验显示，G_C11-opt在HEK293T细胞表面的表达量达VSV-G_WT的81±24%，显著高于G_C11；Western blot检测发现，G_C11-opt整合到伪型VSV包膜的效率比G_C11提升约2倍；感染实验中，由G_C11-opt包裹的伪型化VSVΔG-GFP的滴度比G_C11提升7倍，接近VSV-G_WT水平。

       进一步对S422位点的探究发现：将S422I替换为其他疏水氨基酸时，伪型病毒滴度与G_C11-opt无显著差异；若替换为非疏水的甘氨酸，滴度则回落至G_C11水平。结合结构分析可知，S422I通过与邻近的F424、L430形成疏水堆积作用，稳定VSV-G的β-发夹结构，而H22N虽分子机制尚不明确，但可显著提升嵌合体的细胞表面表达，二者协同修复了纳米抗体融合导致的功能缺陷。

图2：VSV-G 422位氨基酸特性对纳米抗体融合兼容性的影响

优化骨架对不同纳米抗体的兼容性验证

       为确认优化骨架的通用性，研究团队将11种不同纳米抗体融合于优化前后的VSV-G骨架，对比伪型VSVΔG-GFP的滴度。

       结果显示，11种纳米抗体中，9种在优化骨架中的伪型病毒滴度显著提升，优化因子范围为6.5-29，几何均值达11。其中，C8纳米抗体的优化效果最显著，优化因子达29.5；H1-H6等抗HER2纳米抗体的优化因子也均在6.5以上，证明优化骨架对多数纳米抗体具有良好兼容性，尤其适用于抗HER2纳米抗体的融合。

靶向嵌合体构建与特异性验证

       为实现精准靶HER2阳性细胞，研究团队在HER2优化嵌合体（如 H1-opt、H2-opt等）中引入K47Q或R354Q突变，消除其与LDL-R的结合能力。同时，构建HER2敲除细胞系（HEK293T-HER2KO），通过对比HEK293T（HER2阳性）与HEK293T-HER2KO（HER2阴性）的感染效率，验证靶向特异性。

图3：抗HER2纳米抗体嵌合体的功能优化与靶向性验证

       实验结果显示：在HEK293T细胞中，含K47Q/R354Q的抗HER2嵌合体伪型VSV滴度与VSV-G_WT无显著差异；而在HEK293T-HER2KO细胞中，其滴度显著降低，与仅含K47Q/R354Q的非靶向突变体（G_K47Q、G_R354Q）相当。在高表达HER2的SKBR3乳腺癌细胞中，含K47Q/R354Q的抗HER2嵌合体伪型慢病毒的感染效率相比G_K47Q/G_R354Q有数十倍至上百倍的显著提升。

图4：HER2靶向嵌合体伪型慢病毒的感染特异性验证

       为进一步验证选择性，研究团队共培养HEK293T（HER2阳性）与HEK293T-HER2KO（RFP标记，HER2阴性）细胞，发现含K47Q/R354Q的抗HER2嵌合体伪型VSV对HER2阳性细胞的选择性指数为2.25-4，充分证明其可特异性识别并感染HER2阳性细胞。

图5：VSV嵌合体在混合细胞中的靶向选择性验证

       该研究首次筛选出普适性很强的VSV-G优化骨架，解决了N端融合纳米抗体导致的功能缺陷问题，实现了VSV和慢病毒对HER2阳性肿瘤的精准靶向，降低脱靶毒性，推动体内精准治疗的应用研究。同时，该嵌合体可用于工程化细胞外囊泡，实现药物、基因等载物的靶向递送，拓展治疗场景。且该研究建立的“VSV-G优化骨架+纳米抗体”技术具有一定的通用性，这种策略为不同疾病的新型靶向药物研究提供了新的思路。

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参考文献：Duquénois, Isoline et al. “Optimization of the VSV-G backbone for amino terminal fusion with nanobodies allowing its specific retargeting to HER2 receptors.” Molecular therapy. Oncology vol. 33,4 201065. 25 Sep. 2025, doi:10.1016/j.omton.2025.201065