GPCRs是药物研发领域中的热门，全球约30%的上市药物以其为作用对象。AT1R作为GPCR家族的代表性成员，通过结合AngII(内源性配体血管紧张素II)激活Gq蛋白信号通路，引发血管收缩等生理反应，其功能异常直接关联高血压、心肌肥厚等多种心血管疾病。尽管ARBs类降压药物已广泛应用，但传统拮抗剂存在作用机制单一、部分患者响应不佳等问题。
更关键的是，GPCR激活具有“偏向性信号传导”特性，即不同配体可选择性激活特定信号通路。如：已有研究表明β-arrestin偏向性AT1R激动剂能在不影响血压的前提下改善心肌收缩功能，为心力衰竭治疗提供了新方向。但肽类配体结合型GPCR构象具有高度动态、难以结晶的特点，且科研人员一直缺乏其活性状态的高分辨率结构，无法明确配体与受体的相互作用细节，也难以解释偏向性激动剂的作用机制。此前报道的AT1R晶体结构均为拮抗剂结合的失活态，与肽类激动剂的结合模式存在本质差异，亟需获取其活性态结构以填补研究空白。
本研究首次成功解析了人源AT1R在活性状态下的晶体结构，分辨率达2.9Å。该结构揭示了AT1R与部分激动剂S1I8肽的详细结合模式，并展示了一种由合成纳米抗体(Nb.AT110i1)稳定的受体构象。研究不仅阐明了AT1R的独特激活机制，还揭示了其与已知GPCR激活模式的显著差异，为理解偏向性信号传导提供了结构基础。
合成纳米抗体的筛选与优化
GPCR构象的动态性和不稳定性是结晶研究的主要障碍，而纳米抗体凭借其小尺寸、长抗原结合环等优势，成为稳定目标构象的理想工具。但传统免疫接种方法难以获得 AT1R 特异性纳米抗体，团队转而采用合成酵母展示纳米抗体库进行筛选。
筛选过程分为两步：首先通过两轮MACS富集AT1R结合型纳米抗体，随后利用FACS筛选构象特异性克隆，将酵母与奥美沙坦结合的AT1R(AF488标记)和AngII激动剂结合的AT1R(AF647标记)共孵育，选择性收集与活性态AT1R结合的酵母克隆。最终获得高特异性纳米抗体Nb.AT110。研究发现，它仅在激动剂存在时与AT1R发生共免疫沉淀，并能将AngII对AT1R的亲和力提升约6倍。
图1：酵母展示技术筛选活性态 AT1R 特异性纳米抗体
为满足结晶需求，团队通过易错PCR构建突变库，经两轮FACS亲和力成熟，筛选出含A31V、N58D、I98V、Y113N四个关键突变的变体Nb.AT110i1(图 2)。该变体对活性态 AT1R 的亲和力较原始抗体提升超 100 倍，为后续复合物结晶奠定了基础。
图2：Nb.AT110 的亲和力成熟
AT1R-配体-纳米抗体复合物结晶与结构解析
为解决传统AT1R结晶构建体亲和力低下的问题，团队重新设计了蛋白质表达与结晶的构建体。在第三细胞内环(ICL3)插入热稳定蛋白BRIL，保留N端完整序列，以避免影响肽类配体结合，并进行C端截短。该构建体对AngII的亲和力较野生型提升2倍，且能与Nb.AT110i1稳定结合。
研究选用AngII类似物S1I8作为配体，与AT1R、Nb.AT110i1形成三元复合物，通过脂立方相结晶法获得衍射质量晶体。整合5个晶体的衍射数据后，利用分子置换法解析出2.9Å分辨率的晶体结构。结构显示，Nb.AT110i1结合于AT1R的细胞内转导子口袋，其超长CDR3环插入受体核心区域，稳定了活性态特有的构象变化。
图3：Nb.AT110i1稳定的AT1R活性态结构
AT1R激活机制与配体结合模式的揭示
结构分析发现，AT1R的激活机制具有独特性：S1I8以延伸构象结合于受体口袋，N端朝向细胞外溶剂，C端深埋于受体核心，通过极性与疏水作用形成广泛界面。
图4：S1I8与AT1R的结合模式
配体C端的I8残基与受体K1995.42等位点的相互作用引发构象级联反应——W2536.48与Y2927.43向下位移，触发TM5与TM6 间的苯丙氨酸棘轮重排，最终导致TM6向外位移11Å，形成G蛋白结合位点。
图5： AT1R的激活机制
与其他GPCR不同，AT1R通过N1113.35与 N2957.46的氢键替代钠离子稳定失活态，且其活性态结合口袋经TM5、TM7向内位移显著收缩，与拮抗剂结合的失活态口袋形成明显差异，解释了ARBs类药物反向激动作用的特性，这种特性不仅阻断激动剂作用，还能抑制受体的基础活性。此外，S1I8与AT1R的N端、ECL2形成独特的半β桶结构，即肽链与受体片段共同形成了一个不完整的β桶状结构，这种结合模式在肽类GPCR中较为独特。这一结合模式为肽类GPCR的配体识别机制提供了新认知。
图6：活性态与失活态AT1R结合口袋的差异
偏向性信号传导的结构基础验证
团队通过DEER光谱分析证实，AT1R的构象集合(conformational ensemble)与配体类型密切相关：AngII全向激动剂稳定的构象与晶体结构高度一致，而β-arrestin偏向性激动剂则稳定不完全激活的构象。结构显示，配体C端残基的体积差异是偏向性的关键，F8的苯环结构引发受体核心更大程度的构象重排，而小体积残基则无法完全触发这一过程，导致信号传导偏向β-arrestin通路。这一发现为设计高选择性偏向性药物提供了明确的结构靶点。
本研究不仅首次揭示了AT1R的活性结构，更展示了合成纳米抗体在GPCR结构生物学中的强大潜力。Nb.AT110及其变体仅在激动剂存在时与AT1R结合，不与失活态受体或其他GPCR交叉反应，这种精准靶向性确保了活性态构象的稳定捕获，解决了 GPCR 结构研究中构象异质性的核心难题。随着这类工具与方法的推广，未来我们将有望看到更多“难以捉摸”的膜蛋白结构被解析，为药物研发与疾病治疗带来革命性突破。
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