HSV要成功感染宿主细胞，必须完成“附着-融合”两步关键动作，其中gB蛋白是执行膜融合步骤的核心蛋白。它需要从“融合前构象”转变为“融合后构象”才能完成感染。然而，由于融合前gB蛋白是一种“metastable(亚稳态)”结构，脱离病毒膜后极易自发转变为融合后构象，因此，科学家长期以来无法解析其完整结构，也难以开发出能精准锁定这一构象的靶向分子。
今年9月3日，由德国汉堡结构系统生物学中心(CSSB)、莱布尼茨病毒学研究所等机构在《Nature》期刊上联合发表了一篇标题为“A nanobody specific to prefusion glycoprotein B neutralizes HSV-1 and HSV-2”的研究文章。文章表明该研究团队通过创新的“gB囊泡免疫+噬菌体展示”技术，从羊驼体内筛选出一款可特异性结合融合前gB蛋白的纳米抗体Nb1_gbHSV。该纳米抗体不仅能以1.2 nM的IC₅₀高效中和HSV-1，还可跨血清型结合HSV-2 gB。借助突变稳定与冷冻电镜技术，团队首次解析出HSV-1 gB全长融合前结构及HSV-2 gB融合前/后结构，揭示Nb1_gbHSV通过结合跨DI/DIII/DIV结构域的构象表位，锁定gB融合前状态以阻断膜融合，为HSV治疗与疫苗设计提供了“结构-功能”双重突破。
纳米抗体制备：模拟病毒天然状态突破筛选瓶颈
传统抗体制备常因纯化gB构象改变失败，研究人员创新性地采用gB囊泡免疫策略，将HSV-1 gB基因转染至BHK-21细胞，并收集细胞分泌的胞外囊泡。这些囊泡表面同时存在gB的融合前与融合后构象，完美模拟了病毒表面蛋白的天然状态。研究人员在将这类囊泡作为抗原免疫羊驼后，构建了噬菌体展示文库，再以gB囊泡为“诱饵”筛选阳性克隆。
经过两轮筛选与测序验证，17个候选纳米抗体进入活性测试阶段。在HSV-1斑块减少实验中，两个纳米抗体表现出抑制活性，但仅Nb1_gbHSV在低浓度下依然有效，当浓度低至1.2 nM时，即可抑制50%的病毒斑块形成(IC₅₀=1.2 nM)，而其他16个抗体要么无活性，要么需极高浓度才起效。这一步不仅筛选出目标纳米抗体，更证明了“囊泡免疫”策略可引导免疫系统识别天然状态下的融合前构象表位。
图1：纳米抗体制备与活性验证
HSV gB蛋白结构稳定与结构解析
为了解析融合前gB的结构，研究人员首先需解决其亚稳态问题，基于前期HSV-1 gB的低分辨率模型，他们设计了三类稳定突变：一是通过双半胱氨酸突变(如 S392C/Q532C)在DI与DIII间形成二硫键，阻止结构域分离；二是将Domain V(DV)区域的第709位的天冬酰胺(N709)突变为缬氨酸(V)，增强螺旋疏水性以稳定三聚体核心；三是保留此前发现的H516P突变，这种突变破坏了DIII中央螺旋的伸展能力。
通过冷冻电镜断层扫描观察，单一突变虽能提升融合前构象比例，但仍存在局部构象不稳定。最终，研究人员将上述多种稳定突变(包括S392C/Q532C二硫键、N709V和H516P)组合到一个构建体中，成功使gB囊泡表面的蛋白100%保持融合前构象。结果表明，仅当四种突变组合时，gB囊泡表面的蛋白才能完全保持融合前构象，且这些突变牢牢锁住了gB的关键结构域，为后续高分辨率结构解析奠定了基础，也为其他亚稳态病毒蛋白的稳定提供了可复用策略。
图2：稳定HSV gB融合前构象
研究团队将稳定后的HSV-1 gB重组到肽圆盘中，然后通过单颗粒冷冻电镜解析出分辨率2.74 Å的融合前结构。该结构首次揭示了多个此前未被发现的关键特征：N端90-106残基形成α螺旋，嵌入DI与DII之间的凹槽，通过疏水作用(L97、I104)与盐桥(R98-E152)稳定构象；融合环I(174-179残基)并非传统认为的线性结构，而是卷曲成2圈3₁₀螺旋，恰好嵌入MPR(膜近端)区域的疏水凹槽中。
图3：HSV-1 gB融合前全长结构
图4：MPR与融合环的相互作用
更关键的是，当团队将Nb1_gbHSV与稳定后的gB共孵育后，解析出3Å分辨率的复合物结构。结果显示，Nb1_gbHSV的结合表位极具特殊性，它同时跨越DI、DIII与DIV三个结构域，这些区域在融合前构象中因结构紧凑而邻近，但在融合后构象中会因gB重排而分散至不同位置。通过微尺度热泳动测定，Nb1_gbHSV与融合前 gB的结合亲和力高达14 pM，而对融合后gB无任何结合能力，这也解释了其构象特异性中和机制。
图5：Nb1_gbHSV与gB的结合模式
跨血清型验证：从HSV-1到HSV-2的“广谱防护”
考虑到HSV-2是生殖器疱疹的主要病原体，研究团队进一步验证 Nb1_gbHSV对HSV-2的作用。在细胞共定位实验中，研究人员用Alexa 647标记的Nb1_gbHSV可与带sfEGFP标签的HSV-2 gB在BHK-21细胞膜上共定位，而对VZV(水痘带状疱疹病毒)、HCMV(人巨细胞病毒)的gB无结合能力，证明其跨血清型特异性。
更重要的是，团队成功解析出HSV-2 gB融合前与融合后的结构。对比发现，HSV-2 gB的融合前构象与HSV-1高度相似，尤其是Nb1_gbHSV结合的表位残基完全保守，这为其跨血清型中和能力提供了结构依据。在冷冻电镜图谱中，仅在HSV-2 gB融合前构象上观察到Nb1_gbHSV的密度，进一步证实它能锁定HSV-2 gB的融合前状态。
图6：HSV-2 gB融合前结构与Nb1_gbHSV结合
过去，由于HSV病毒的藏匿性与耐药性使得传统抗体在该领域难以获得重要性突破。无独有偶，纳米抗体技术在HSV治疗领域的潜力近期得到了多方印证。今年5月，由中国科学技术大学研究团队发表于《Nature》的研究表明，该团队同样以纳米抗体作为核心研发出一种双特异性纳米抗体Nb14-32-Fc，这种纳米抗体则以HSV的gD蛋白为核心靶点，采用“双表位协同+Fc段功能增强”的创新设计，将纳米抗体靶向gD蛋白的两个不同非重叠的表位，二者协同作用使双特异性抗体对HSV-2 gD的结合亲和力提升至24.1 pM，比单一靶向的纳米抗体高出两倍。关键的是，这种双靶点协同机制不仅对HSV-1/2的病毒附着前阶段与附着后阶段均有强效的中和能力，还能显著的抑制病毒的细胞间传播，抑制率超过90%，在体内模型中，1mg/kg剂量即可使HSV-1颅内感染的小鼠存活率达80%，并能快速治愈阿昔洛韦耐药株引发的角膜溃疡，同时通过Fc段激活免疫效应，为干预病毒潜伏微环境提供了可能。
而今天，这项来自德国汉堡结构系统生物学中心等机构的研究不仅填补了HSV膜融合机制的研究空白，更为抗病毒治疗与疫苗研发提供了“结构-功能”双驱动的新路径，该研究还更进一步地验证了纳米抗体在抗HSV病毒领域的优势，纳米抗体凭借“小分子+高特异性”可精准靶向HSV的亚稳态表位，且“跨血清型+耐药性低”的特性突破了现有治疗性抗体的研究局限，为临床治疗研究提供了关键工具。
结合这两项研究，纳米抗体有望改变现有治疗格局，而研究本身的技术策略与结构策略，将持续推动纳米抗体在更广泛抗病毒领域的应用，为全球公共卫生安全贡献力量。
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